Optimizarea condițiilor de reacție pentru a obține un randament ridicat de Stevia Rebaudioside D
Dietele bogate în zahăr au dus la creșterea prevalenței diverselor boli cronice, inclusiv obezitate, diabet, boli cardiovasculare și hipertensiune, reprezentând o problemă semnificativă de sănătate publică la nivel global. Stevia Rebaudioside D (Reb D), un îndulcitor natural derivat din plante, a atras o atenție semnificativă ca substitut de zahăr datorită conținutului său de zero calorii, dulceața intensă și profilul gustos plăcut.
Totuși, prezența sa limitată în stevia rebaudiana Bertoni și provocările legate de solubilitatea scăzută și activitatea enzimatică a glicoziltransferazei derivate din plante au împiedicat aplicarea sa comercială pe scară largă. Ca răspuns la aceste probleme, a fost descoperită o nouă glicoziltransferază numită YojK, originară din Bacillus subtilis 168. Acest studiu introduce o glicoziltransferază bacteriană modificată genetic, YojK-I241T/G327N, caracterizată printr-o solubilitate ridicată și eficiență catalitică, oferind un potențial mare pentru producția la scară industrială a Reb D.
Dezvoltarea unei metode extrem de eficiente pentru producția rebaudioside D folosind o reacție în cascadă a enzimelor YojK-I241T/G327N și AtSuSy.
Pentru a aborda problema solubilității scăzute în glicoziltransferazele derivate din plante, cercetătorii au investigat potențialul utilizării YojK, o O-glicoziltransferază din Bacillus subtilis 168. YojK a fost ales datorită activității demonstrate de glicozilare cu diverse substraturi, inclusiv molecule mari. După exprimarea și purificarea recombinantelor cu succes, YojK a fost folosit pentru a glicozila Reb A, rezultând producerea Stevia Reb D. Analiza cinetică enzimatică a arătat că YojK are o activitate catalitică mai scăzută față de Reb D comparativ cu alte glicoziltransferaze. Prin urmare, studiul sugerează necesitatea ingineriei ghidate de structuri pentru a spori activitatea catalitică a lui YojK în scopuri practice potențiale. (așa cum este prezentat în Figura 1)
Figura 1
Optimizarea condițiilor de reacție pentru a obține un randament ridicat al rebaudioidului D.
Condițiile de reacție, inclusiv pH, temperatura și concentrația substratului, pot fi optimizate pentru a obține un randament ridicat al Srevia Reb D. Studiul a folosit simulări de dinamică moleculară pentru a investiga modul în care varianta YojK-I241T/G327N sporește glicozilarea Reb D. Varianta a menținut o legătură stabilă de hidrogen între Reb A și H14 în timpul simulărilor, spre deosebire de tipul sălbatic (așa cum este prezentat în Figura 2). Această stabilitate se extindea și la distanța dintre atomul de O2 al lui Reb A și C1P al UDPG. Eficiența catalitică îmbunătățită a variantei YojK-I241T/G327N a fost atribuită acestor interacțiuni stabile, sugerând potențialul său practic.
Figura 2
Figura 3
Concluzie
Această abordare a generat 83,47% Reb D. Notabil, adăugarea a 1 mM UDPG a permis sinteza a 20,59 g/L Reb D cu un randament remarcabil de 91,29%, depășind studiile anterioare. Acest proces demonstrează potențialul producției la scară industrială a Reb D, mai ales după ingineria structurală a YojK.YojK poate fi exprimat eficient în E. coli BL21 (DE3) cu solubilitate ridicată. Prin inginerie ghidată de structură, a fost creat un dublu mutant, YojK-I241T/G327N, care a permis producția la scară largă a Reb D cu un randament excepțional de 91,29% prin reciclarea UDPG catalizată de sucroza sintaza AtSuSy. Acest studiu prezintă YojK-I241T/G327N ca un instrument promițător pentru producția Reb D la scară industrială eficientă din punct de vedere economic.
