Cuantificarea NAD+ și metaboliții săi în nervii sciatici ai șoarecelui
Introducere
Părțile cruciale ale nicotinamidei adenină dinucleotid (NAD+) și ale metaboliților săi în îmbătrânire și neurodegenerare au fost larg recunoscute. Pentru a stimula progresul către cercetarea biochimică și intervențiile care vizează îmbătrânirea și bolile neurodegenerative, este de mare importanță cuantificarea precisă a NAD+ și a nivelurilor sale de metaboliți în calea de salvare NAD+. Aici, se aplică o metodă robustă și precisă LC-MS/MS pentru a cuantifica NAD+ și nivelurile sale de metaboliți în nervul sciatic normal și lezat al șoarecului.Limitările metodelor existente pentru cuantificarea NAD+ și a metaboliților săi
Metodele tradiționale de cuantificare a NAD+ și a metaboliților săi, cum ar fi HPLC-UV, NMR, electroforeza în zona capilară sau testele enzimatice colorimetrice, se confruntă cu diverse provocări în sensibilitate, selectivitate și măsurare indirectă. În ceea ce privește testele existente LC-MS/MS pentru măsurătorile NAD+ celulare sau tisulare și metaboliții săi, există încă multe dificultăți de depășit, cum ar fi timpii prelungiți de funcționare, comportamentul slab de retenție cromatografică și formele de vârf nesatisfăcătoare. Mai mult, doar una până la trei substanțe din calea de salvare NAD+ pot fi acoperite de aceste metode.Modificările metodei LC-MS/MS
Pe baza testelor LC-MS/MS existente, se realizează modificările privind condițiile cromatografice, matricea de substituție și condițiile MS/MS. Mai exact, 5 μM de acid metilen fosfonic este folosit ca aditiv în faza mobilă, ceea ce promovează explicit intensitatea semnalului și forma de vârf. Având în vedere natura relativ curată și simplă a probelor niciodată și dimensiunea lor mică, apa ultrapură este testată ca o matrice substitutivă. În locul coloanei de cromatografia lichidă cu interacțiune hidrofilică și coloana hipercarb, se utilizează coloana Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, a cărei tehnologie unică MaxPeak HPS de suprafață de înaltă performanță (pasivarea peretelui interior al coloanei, eliminarea suprafeței metalice) permite reproductibilitatea ridicată, simetria maximă și separarea de bază a tuturor analiților. În plus, condițiile MS sunt optimizate pentru a minimiza semnalul de interferență NAD+ în canalul ciclic de adenozin difosfat riboza (cADPR), menținând în același timp răspunsul cADPR și al mononucleotidului nicotinamidă (NMN), cu 4000V pentru tensiunea de pulverizare a ionilor, 450°C pentru temperatura încălzitorului turbo, 50 psi pentru gazul 1, 50 psi pentru gazul 2, 30 psi pentru gazul de cortină și 12 psi pentru gazul de coliziune.
Cromatogramă reprezentativă a probelor nervoase (normale vs leziate)
Toți cei cinci analiți ating separarea de bază, unde cADPR este un biomarker sensibil în modelul neurodegenerării. Aici, axotomia nervului sciatic induce degenerescența axonală, ceea ce duce la scăderea nivelului de NAD+ și la creșterea nivelului NMN în nervii afectați, rezultând o creștere de aproximativ două ori a raportului NMN/NAD+. În același timp, nivelurile de nicotinamidă (NAM) și adenozin difosfat riboza (ADPR) sunt scăzute de aproximativ 2 ori, în timp ce nivelul cADPR este crescut de peste 8 ori. Aceste rezultate sunt în concordanță cu cele ale cercetărilor raportate anterior, verificând acuratețea acestei metode modificate LS-MS/MS în cuantificarea NAD+ și a metaboliților săi.
Concluzie
Această metodă modificată LC-MS/MS permite separarea eficientă de bază a NAD+, NMN, NAM, ADPR și cADPR într-un timp scurt de 5 minute, ceea ce contribuie la diagnosticarea timpurie a diferitelor tulburări neurologice și dezvoltarea de medicamente pentru îmbătrânire și boli neurodegenerative.Referință
Ma Y, Deng L, Du Z. Dezvoltarea și validarea unei metode LC-MS/MS pentru cuantificarea NAD+ și a metaboliților înrudiți la nervii sciatici la șoareci și aplicarea acesteia la un model animal cu leziuni nervoase. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACs-a dedicat cercetării și dezvoltării, fabricării și vânzării de materii prime pentru coenzime și produse naturale din 2012, având fabrici proprii, peste 170 de brevete la nivel global, precum și o echipă puternică de cercetare și dezvoltare. BONTAC are o experiență bogată în cercetare și dezvoltare și tehnologie avansată în biosintezaNAD și predecesorii săi(de exemplu, NMN și NR). Există diverse tipuri de NAD care pot fi selectate, incluzând NAD ER Grade (îndepărtarea endoxinei), NAD Gradul I (IVD/supliment dietetic/pulbere brută cosmetică), NAD Gradul II (API/intermediari) și NAD Gradul IV (dacă există cerințe mai mari privind solubilitatea), care pot fi furnizate sub formă de pulbere liofilizată sau pulbere cristalină. Puritatea NAD-ului BONTAC poate depăși 98%.
