Ingineria enzimelor cuplate de creștere prin manipularea regenerarii cofactorilor redox

O gamă tot mai largă de substanțe chimice este acum produsă din materii prime regenerabile prin mijloace biotehnologice. Bioprocesele se bazează în mare măsură pe cataliza enzimatică pentru producția eficientă a acestor compuși. Asigurarea funcționării optime a enzimelor în mediul necesar este, prin urmare, de mare interes pentru producția durabilă.

Proprietăți precum specificitatea substratului, rata catalitică și (termo)stabilitatea sunt printre mai mulți factori critici care trebuie optimizați pentru bioprocese eficiente conduse de enzime. Această optimizare poate fi consumatoare de timp, costisitoare și provocatoare și, prin urmare, metode eficiente și eficiente din punct de vedere al costurilor pentru selecția cuplată în funcție de creștere, enzimele inginerești cu caracteristici dorite sunt foarte căutate.

Avantajele utilizării selecției cuplate de creștere ca formă de selecție enzimatică, care implică legarea activității unei enzime de creșterea unei celule. Această metodă poate fi folosită ca o strategie de selecție cu debit ridicat și poate fi realizată fie prin asigurarea faptului că creșterea depinde de sinteza produsului de către enzima țintă, fie prin legarea activității enzimei de starea globală de energie a celulei. Biologia sintetică poate fi folosită pentru a crea tulpini potrivite pentru selecția cuplată în creștere, iar progresele recente s-au concentrat pe ingineria tulpinilor deficitare în stările oxidate sau reduse ale perechilor de cofactori redox, care pot servi drept platforme de inginerie enzimatică. Utilizarea acestor platforme poate accelera dezvoltarea unor biocatalizatori și bioprocese îmbunătățite.

Beneficiile cuplării de creștere prin auxotrofie a cofactorilor

Beneficiile utilizării auxotrofiei cofactorilor ca metodă de selecție pentru enzimele inginerești implicate în biosinteza anumitor substanțe chimice, precum lipide, biocombustibili, gaze, solvenți organici sau compuși polimerici. Această abordare oferă mai multe beneficii unice, inclusiv posibilitatea de a selecta produsul dorit independent de substratul sau produsul de interes, facilitarea detectării unei activități enzimatice îmbunătățite și oferirea unui indicator pentru detectarea unei activități enzimatice îmbunătățite. În plus, utilizarea auxotrofelor cofactorilor ca platforme de cuplare a creșterii este benefică deoarece natura omniprezentă a cofactorilor redox în metabolismul microbian înseamnă că strategiile inginerești pot fi transferabile lateral către alți microbi de interes, iar enzimele pot fi proiectate direct în mediul gazdei microbiene dorite. (prezentat ca figura 1)

Figura 1: Comparația mai multor tehnici larg utilizate de screening/selecție pentru ingineria enzimelor

Mutanți deficitari în oxidarea NADH

Oxidarea NADH în E. coli poate avea loc prin două căi, în funcție de disponibilitatea oxigenului. În condiții aerobe, NADH este oxidat în principal prin respirație pentru a genera ATP, în timp ce în condiții anaerobe poate fi oxidat prin căi de fermentație pentru a produce lactat și etanol. Tulpinile mutante de E. coli, incapabile să folosească căi mixte de fermentație pentru oxidarea NADH în timpul creșterii anaerobe, au fost folosite pentru a conduce căi oxidante NADH pentru sinteza anaerobă a diferitelor substanțe chimice, precum 2-metilpropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol și L-alanină. Aceste tulpini mutante au fost folosite și pentru a crea enzime prin exploatarea unor principii redox similare, ceea ce a dus la variante îmbunătățite. Tulpinile rezultate pot fi folosite pentru a crea alte enzime și căi dependente de NAD(P)H.

Mutanți deficitari în reducerea NAD+  

Wenk și colab. au creat o tulpină de E. coli prin eliminarea genei dihidrolipol dehidrogenază (lpd), ceea ce a făcut ca tulpina să nu poată genera putere reducătoare (NADH și NADPH) din metabolismul acetatului, din cauza absenței activității piruvatului dehidrogenază. Acest lucru a făcut ca tensiunea să manifeste auxotrofie pentru reducerea puterii atunci când este crescută aerobic pe acetat ca sursă unică de carbon. (prezentat ca figura 2) Tulpina a putut crește pe acetat atunci când a fost suplimentată cu substraturi glicolitice superioare sau când a exprimat dehidrogenaze formate, etanol sau metanol dependente de NAD+ cu substraturile lor respective. Tulpina nu a fost folosită pentru ingineria enzimelor și a fost evaluată doar pentru auxotrofia cofactorilor redox.
 

Figura 2: Metabolismul Central 

Mutanți deficitari în oxidarea NADPH

Există două strategii diferite pentru inducerea auxotrofiei NADP+ în E. coli, bazându-se pe creerea căii glicolitice pentru a produce excesiv NADPH. Prima strategie implică eliminarea genei gapA native și exprimarea unei enzime GAPDH heterologe dependente de NADP+, în timp ce a doua strategie implică redirecționarea fluxului de carbon prin calea pentozei fosfat. Tulpinile rezultate nu pot crește pe glucoză, dar prezintă creștere în condiții diferite, prima tulpină crescând în condiții anaerobe, iar a doua în condiții aerobe, cu glicerol ca substrat. Aceste tulpini sunt folosite pentru inginerie a enzimelor cu proprietăți îmbunătățite, inclusiv specificitatea substratului, activitatea catalitică și termostabilitatea.

Mutanți deficitari în reducerea NADP+

Trei bacterii diferite, E. coli, P. putida și C. glutamicum, au fost modificate pentru a fi NADPH-auxotrofice, ceea ce înseamnă că au nevoie de NADPH exogen pentru creștere. În cazul E. coli și C. glutamicum, enzimele metabolice centrale au fost eliminate pentru a evita reducerea NADP+ atunci când glucoza a fost furnizată ca sursă de carbon, în timp ce la P. putida, ingineria asistată de CRISPR/nCas9 a fost folosită pentru a perturba secvențial seturi de gene țintă, pentru a înțelege implicarea lor în metabolismul redox. Tulpinile auxotrofe NADPH au fost apoi folosite pentru ingineria enzimelor cuplate de creștere bazată pe specificitatea cofactorilor. O singură rundă de mutageneză folosind E. coli a oferit cea mai eficientă și specifică dehidrogenază formatată dependentă de NADP+ până în prezent, în timp ce P. putida și C. glutamicum reprezintă primele tulpini ale speciei lor care pot fi folosite pentru acest tip de inginerie.

Mutanți deficitari în reducerea NMN+

A fost dezvoltat un sistem de selecție cuplată în creștere pentru a lega ciclul cofactorilor de creștere, bazat pe o deficiență a reducerii NMN+. A fost folosită tulpina E. coli SHuffle, care poartă deleții în două gene implicate în producția de glutațion redus. A fost dezvoltată o reductază de glutation dependentă de NMNH prin mutageneză rațională pentru a lega procesul de ciclurile NMN+/NMNH, iar o dehidrogenază dependentă de NMN+ a fost folosită pentru a susține ciclul cofactorilor NMN+/NMNH și, prin urmare, creșterea. Studiul a aplicat, de asemenea, auxotrofia cofactorului redox necanonic pentru ingineria enzimelor cuplate de creștere pentru prima dată, rezultând o variantă termostabilă a fosfiților dehidrogenaza cu eficiență catalitică îmbunătățită și stabilitate temporală in vitro. Lucrarea oferă o tulpină utilă pentru ingineria enzimelor cuplate de creștere, dependentă de ciclurile NMN+/NMNH și auxotrofă pentru starea redusă a unui cofactor redox necanonic.

Potențialul cuplării creșterii prin cofactorii redox a funcționat ca un instrument puternic pentru a crea biocatalizatori, în special în contextul bioproducției durabile. Deși s-au făcut progrese considerabile în generarea tulpinilor auxotrofe cu cofactor redox, declarația sugerează că există încă mai multe căi neexplorate pentru cercetare. Una dintre acestea implică ingineria tulpinilor auxotrofe cofactorice ale unor organisme diferite de E. coli, ceea ce ar putea deschide noi posibilități pentru ingineria enzimelor cuplate de creștere.

Per ansamblu, sugerează că utilizarea cuplării de creștere bazate pe cofactori redox reprezintă o oportunitate majoră pentru ingineria biocatalizei, în special pentru producția de produse care nu pot satisface cerințele altor abordări de inginerie enzimatică cu debit ridicat. Subliniază necesitatea dezvoltării unor biocatalizatori mai versatili și eficienți pentru bioproducția durabilă și subliniază importanța cercetării continue în acest domeniu.


Referință: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Ingineria enzimelor cuplate de creștere prin manipularea regenerarii cofactorilor redox, Biotechnology Advances, 2023.